还给初学者：常用的细胞凋亡检测方法

在测试中所往往所需侦测细胞的凋亡情况，这里揭示了几种罕见的凋亡侦测作律，努力需要帮到你。

一细胞凋亡的遗传学侦测

遭遇凋亡的细胞在形态上有一定的特征。

透镜透镜透镜容器和倒置透镜透镜容器

仍未皮肤上细胞：凋亡细胞的尺寸变为、扭曲，细胞凝胶明晰但造显现出发泡反常，细胞凋亡后半期可见凋亡小基底。贴壁细胞造显现出皱缩、变圆、松脱。

皮肤上细胞：常用姬姆萨皮肤上、瑞氏皮肤上等。凋亡细胞的细胞器油脂、被忽视，氘凝胶硫简化、细胞器分割如此一来块状和凋亡小基底等类似的凋亡形态。

红以外透镜透镜容器和总共整合红以外扫描透镜透镜容器

一般以细胞器细胞器的遗传学变动为指亦同来发型师细胞凋亡的令人满意情况。

常用的 DNA 免疫树脂有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种树脂与 DNA 的建构都都是低功耗的，主要建构在 DNA 的 A-T 双螺旋区。紫以外光唤起时发射器明亮的蓝色红以外。

Hoechst 是与 DNA 特异建构的来时性树脂，内含试管用蒸馏水配如此一来 1 mg/ml 的电导率，使用时用 PBS 酒精，终因电导率为 10 μg/ml。

DAPI 为半通透性，可用同样分开细胞的皮肤上。内含试管用蒸馏水配如此一来 1 mg/ml 的电导率，使用终因电导率一般为 10 μg/ml。

结果发型师

细胞凋亡更进一步中所细胞器细胞器的遗传学变动总称三期：Ⅰ 期的细胞器呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部份细胞器造显现出油脂状态；Ⅱa 期细胞器的细胞器短一段时间性凝聚、被忽视；Ⅱb 期的细胞器硫简化为碎块，消除凋亡小基底（上图 1）。

入射光电子透镜透镜容器检视

结果发型师

凋亡细胞尺寸变为，细胞器油脂。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞器内细胞器短一段时间性中空，造显现出许多叫做气穴反常（citations）的空泡内部结构；Ⅱa 期细胞器的细胞器短一段时间性凝聚、被忽视；细胞凋亡的后半期，细胞器硫简化为碎块，消除凋亡小基底（上图 2）。

二Annexin V 律

细胞器乙酰磷酸酶（Phosphatidylserine, PS）造显现出异常位于细胞凝胶的下部，但在细胞凋亡的后期，PS 可从细胞凝胶的下部翻转到细胞凝胶的颗粒，暴露在细胞以外环境中所（上图 3）。Annexin-V 是一种分子会存量为 35～36 KD 的 Ca2+ 依赖性细胞器建构激酶，能与 PS 极高灵活性免疫建构。将 Annexin-V 进行时红以外素（FITC、PE）或 biotin 亦同识，以亦同识了的 Annexin-V 作为红以外探针，借助于流式细胞容或红以外透镜透镜容器可侦测细胞凋亡的遭遇。

氟简化丙啶（propidine iodide, PI）是一种氘酸树脂，它没法透过明晰的细胞凝胶，但在凋亡中所后半期的细胞和死去细胞，PI 需要透过细胞凝胶而使细胞器红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将凋亡就有后半期的细胞以及死去细胞区分在在。

作律

水或细胞的皮肤上：将造显现出异常培训和抑止凋亡的水或细胞（0.5～1×106）用 PBS 洒 2 次，转为 100 μl Binding Buffer 和 FITC 亦同识的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，常温下避光 30 min，再转为 PI（50 μg/ml）5 μl，避光简化学反应 5 min 后，转为 400 μl Binding Buffer，立即用 FACScan 进行时流式细胞忍术系统性侦测（一般不最多 1 h）， 同时以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为单有数对照。

贴壁培训的细胞皮肤上：先用 0.25% 的胰激酶进食，洒涤、皮肤上和系统性同水或细胞。

爬造出片细胞皮肤上：同上，仍要用红以外透镜透镜容器和总共整合红以外扫描透镜透镜容器进行时检视。

结果

提醒事项

1. 整个系统设计动作要以求变简化多端，不宜用力吹打细胞。

2. 系统设计时提醒避光，简化学反应先行后尽快在一小时内侦测。

三细胞氘凝胶势能的侦测

细胞氘在细胞凋亡的更进一步中所起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均会抑止不尽相同的细胞遭遇凋亡，而细胞氘一环电导率梯度（Δψm）的上升，被普遍认为是细胞凋亡级联简化学反应更进一步中所最就有遭遇的事件真相，它遭遇在细胞器凋亡特征（细胞器油脂、DNA 折断）造显现出之前，一旦细胞氘一环电导率梯度消亡，则细胞凋亡不可逆转。

细胞氘一环电导率梯度的发挥作用，使一些支链碱金属红以外树脂如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可建构到细胞氘组分，其红以外的减慢或消散说明细胞氘内凝胶阴离子的增极高或降低。

作律

将造显现出异常培训的细胞和抑止凋亡的细胞转为使用终因电导率为 Rhodamine 123（1 mM）或终因电导率为 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 最大限度 30 min，流式细胞不计侦测细胞的红以外其中心。

提醒事项

1. 始终因保持最大限度染试循环系统所 pH 取值的一致性，因为 pH 取值的叠加将影响电导率梯度。

2. 与树脂达到最大限度的细胞悬试循环系统所如果所所含激酶，他们将与部份树脂建构，降低树脂的电导率，造成了实为去极简化。

四DNA 影片简化侦测

细胞凋亡时主要的生简化特征是其细胞器遭遇油脂，细胞器 DNA 在氘小基底其单位之间的前端折断，如此一来型 50～300 kbp 长的 DNA 大面积段，或 180～200 bp 整有数倍的寡氘糖影片，在发射器光谱上表现为菱形电泳上图谱（DNA ladder）。

细胞经处理后，采用同样作律分离纯简化 DNA，进行时琼脂糖发射器光谱和溴简化乙啶皮肤上，在凋亡细胞群中所可检视到类似的 DNA ladder。如果细胞存量甚少，还可在分离纯简化 DNA 后，用 32P-ATP 和嘧啶氘糖一端转移激酶（TdT）亦同识 DNA，然后进行时电泳和等离子自显像，检视凋亡细胞中所 DNA ladder 的如此一来型。

大分子会皮肤上基底 DNA 影片的测出

细胞凋亡的后期，皮肤上基底折断如此一来为 50～300 kbp 长的 DNA 大面积段。所有最多一定分子会存量一般来说的双螺旋 DNA 分子会在琼脂糖胶基底中所的搬迁飞行速度相同。线性 DNA 的双螺旋半径最多胶基底半径时，即达到分辨力的瞬时。此时胶基底不必按分子会存量的一般来说来筛分 DNA，DNA 像通过弯管一样，以其一端指向电势一极而通过胶基底，这种搬迁方式上称之为「爬造出行」。因此，细胞凋亡后期消除的 50～300 kbp 长的 DNA 大面积段没法用普通的琼脂糖发射器光谱来分离。

通常采用脉冲电泳技忍术可圆满地解决这一疑问。这个作律是在胶基底上以外加内积的交变脉冲电势。每当电势同方向变动后，大的 DNA 分子会立刻滞留在爬造出行循环系统所，直至属于自己电势轴向重取而代之定向后，才能在此期间向前移动。DNA 分子会存量越少，这种重排所所需的一段时间就越长。当 DNA 分子会DFT同方向的一段时间多于电脉冲周期时，DNA 就可以按其分子会存量一般来说分开。

DNA Ladder 测出

作律

进帐细胞（1×107）硫酸→细胞硫简化试管→13 000 rpm ×5 min→整理上清代，加 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，一窝 2 h→激酶激酶 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 尺寸 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍尺寸的凝无水混合物硫酸 DNA，4 °C 旅店→14 000 rpm×15 min→仍要将硫酸沉淀在 TE buffer 中所，加 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖发射器光谱，EB 皮肤上并照相。

结果

凋亡细胞 DNA 所含存量的流式细胞不计系统性

作律

整理细胞→70% 凝混合物（PBS 酒精）4 °C 分开旅店→PBS 洒涤，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 进食 30 min→PI（50 mg/ml）皮肤上，常温下避光 15 min→FACScan 系统性 DNA 亚二倍基底的如此一来型及细胞凋亡的叠加。

结果

ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay

特性：阈值极高，适合于侦测少存量样本，小部份凋亡细胞。如医学来时秘密组织侦测。

五TUNEL 律

细胞凋亡中所，皮肤上基底 DNA 双螺旋折断或单链折断而消除大存量的塑性 3'-OH 一端，可在嘧啶氘糖一端转移激酶（TdT）的作用下，将嘧啶氘糖和红以外素、过氧简化物激酶、碱性磷酸激酶或生物素如此一来型的衍生物亦同识到 DNA 的 3'-一端，从而可进行时凋亡细胞的侦测，这类作律叫做嘧啶氘糖一端转移激酶介导的缺口一端亦同识律（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

由于造显现出异常的或悄悄凋亡的细胞几乎无法 DNA 的折断，因而无法 3'-OH 如此一来型，甚少需要被皮肤上。TUNEL 实质上是分子会生物学与遗传学相建构的研究课题作律，对明晰的单个凋亡细胞器或凋亡小基底进行时则会皮肤上，能准确地简化学反应细胞凋亡类似的生物简化学和形态特征，可可用所含硫包埋秘密组织烟熏、冰冻秘密组织烟熏、培训的细胞和从秘密组织中所分离的细胞的细胞形态测出，并可侦测造出极少存量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究课题中所被广泛采用。

六Caspase-3 来时性的侦测

Caspase 家族在介导细胞凋亡的更进一步中所起着非常最主要的作用，其中所 Caspase-3 为关键性的执行分子会，它在凋亡瞬时传导的许多唯一可中所起到功用。Caspase-3 造显现出异常以激酶原（32 KD）的形式发挥作可用胞浆中所，在凋亡的后期期中，它被激来时，再造的 Caspase-3 由两个大蛋白（17 KD）和两个小蛋白（12 KD）分如此一来，硫简化除此以以外的胞浆胞氘残基，终于因致使细胞凋亡。但在细胞凋亡的后半期和死去亡细胞，Caspase-3 的来时性明显上升。

Western blot

系统性 Procaspase-3 的再造，以及再造的 Caspase-3 及对残基聚合（ADP-氘糖）聚合激酶（PARP）等的硫简化。

作律

整理细胞→PBS 洒涤→抽提细胞硫简化试管→激酶系统性→SDS-PAGE 电泳→甘油凝胶或 PVDF 凝胶转移→5% 脱脂封闭，常温下 1.5～2 h 或 4 °C 旅店→Caspase-3 多抗或抗病毒常温下简化学反应 1～2 h 或 4 °C 旅店→TBS-T（所含 0.05% Tween 20 的 TBS）洒 3 次，5～10 min/次→HRP-亦同识的鸡抗鼠 IgG 或 AP 亦同识的鸡抗鼠 IgG 常温下简化学反应 1～2 h→ TBS-T 洒 3 次， 5～10 min/次→ECL 显像或 NBT/BCIP 金属氧化物。

结果

红以外光谱学光度不计系统性

再造的 Caspase-3 需要特异挤压 D1E2V3D4-X 残基，氧简化 D4-X 肽键。根据这一特点，设不计造出红以外气态胺的短肽 Ac-DEVD-AMC。在总配基底胺时，AMC 没法被唤起红以外，短肽被氧简化后释放造出 AMC，自由的 AMC 才能被唤起发射器红以外。根据释放的 AMC 红以外其中心的一般来说，可以测出 Caspase-3 的来时性，从而看造出 Caspase-3 被再造的程度。

作律

进帐细胞造显现出异常或凋亡细胞→PBS 洒涤→制备细胞硫简化试管→加 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 红以外残基）→37 °C 简化学反应 1 h→红以外光谱学光度不计（Polarstar）系统性红以外其中心（唤起光波长 380 nm，发射器光波长为 430～460 nm）。

结果

流式细胞忍术系统性

作律

进帐细胞造显现出异常或凋亡细胞→PBS 洒涤→加 Ac-DEVD-AMC→37 °C 简化学反应 1 h→UV 流式细胞不计系统性 Caspase-3 阳性细胞有数和平均红以外其中心。

结果

七TFAR19 激酶表示和细胞整合系统性

TFAR19（PDCD5）是由本研究课题室在近年来首先报导的一个拥有自己知识产权的生命基底取而代之突变，中期的功用研究课题表明，它是促进细胞凋亡的减慢剂。借助于红以外素（FITC）亦同识的 TFAR19 HIV为探针，对细胞凋亡更进一步中所 TFAR19 激酶的表示水准及整合研究课题发掘出，凋亡后期 TFAR19 表示水准增极高并造显现出快速氘二分反常，显现出着细胞器遗传学的叠加，短一段时间短一段时间，在凋亡小基底中所仅仅可见。

同时我们发掘出，凋亡后期 TFAR19 激酶的氘二分就有于细胞器乙酰磷酸酶（PS）变形和细胞器 DNA 的影片简化，提示 TFAR19 激酶的氘二分是细胞凋亡更后期遭遇的事件真相之一。进一步的研究课题证明，凋亡后期 TFAR19 的氘二分很强普遍意义，不尽相同细胞凋亡后期均造显现出 TFAR19 极高表示和氘二分。这为研究课题细胞凋亡后期所遭遇的事件真相，获取了一种属于自己技忍术和指亦同。

TFAR19 激酶的细胞整合系统性

材质盐酸

FITC 亦同识的HIV，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的聚合甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 所含 0.2% Tween 20），胎牛抗基底代，红以外细胞洒试管（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 所含 2% 胎牛抗基底代及 0.1% NaN3），FACS 管，Tip 头，移试管器。

透镜容器

环境温度水准离心机，37 °C 水浴箱，红以外透镜透镜容器，总共整合红以外扫描透镜透镜容器，流式细胞容。

作律

1. 水或细胞的皮肤上

（1）进帐造显现出异常和抑止凋亡的细胞（0.5～1×106），PBS 洒 2 次，1 000 rpm×10 min。

（2）3% 聚合甲醛冰浴 10 min，PBS 洒 2 次，1 000 rpm×10 min。

（3）转为 PBS-T 溶试管，37 °C 一窝 15 min，PBS 洒 2 次，1 000 rpm×10 min。

（4）转为 200 ml 胎牛抗基底代，常温下简化学反应 30 min。

（5）转为 5 ml FITC 亦同识的 TFAR19 抗病毒（终因电导率为 1:40），4 °C 简化学反应 30 min。

（6）红以外细胞洒试管洒 2 次，1 000 rpm×10 min。

将细胞硫酸滴片，红以外透镜透镜容器及总共整合红以外透镜透镜容器下检视 TFAR19 在细胞中所的整合。同时用流式细胞容系统性侦测 TFAR19 激酶的平均红以外其中心。

2. 贴壁细胞的则会皮肤上

（1）贴壁生长的对有数期细胞铺地在 24 孔或 6 孔铁板中所（有有数洁净盖玻片），让其爬造出片生长，待长到 50%～80 % 满时，凋亡抑止剂处理细胞。

（2）将不尽相同一段时间点处理的细胞进行时免疫红以外皮肤上，皮肤上必需同上。

（3）将皮肤上的爬造出片细胞放于一张滴有少存量（5 ml）的载玻片上，红以外透镜透镜容器或总共整合红以外扫描透镜透镜容器检视 TFAR19 在细胞中所的整合。

3. 医学病理烟熏的皮肤上、侦测

4. 原代细胞的培训、侦测

5. 系统性 TFAR19 激酶在基底内各秘密组织器官的分布区及整合

TFAR19 激酶的表示与医学疾病

ELISA 律侦测造显现出异常人和疾病状态下，以及疾病的不尽相同以前，抗基底代中所 TFAR19 激酶水准及其 TFAR19 自身抗基底水准。

材质和盐酸

1. 都从 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 碳酸盐 Buffer

2. 洒涤试管： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 所含 0.05% Tween 20

3. 封闭试管： 3% BSA（用洒涤试管配制）

4. 激酶亦同抗基底的酒精：用封闭试管酒精

5. OPD 残基 Buffer：Na2 HPO4·12 H2O 1.84 g，苯甲酸 0.51 g，DDW 100 ml

6. 金属氧化物试管（现配现用）：残基 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml

7. 终因止试管 2 mol/L H2SO4

8. 重取而代之组建人 TFAR19，HRP 亦同识的鸡抗人 IgG9 ELISA 铁板，Tip，移试管器，ELISA Reader（OD 490 nm），洒击发

系统设计必需

1. 用都从 Buffer 酒精的重取而代之组建人 TFAR19（1 mg/ml）都从 ELISA 铁板，100 ml/well，37 °C 一窝 2 h 或 4 °C 旅店（一般 24 h 以上）。

2. 洒涤 Buffer 洒铁板三次，转为封闭试管，200 ml/well ， 37 °C 一窝 2 h 或 4 °C 旅店。

3. 洒涤 Buffer 洒铁板三次，转为不尽相同酒精度的医护人员抗基底代（3 个减法孔）100 ml/well ，37 °C 一窝 1 h。设都从 Buffer、洒涤 Buffer 、封闭试管为单有数对照。

4. 洒涤 Buffer 洒铁板三次，转为 1:2 500 酒精的 HRP 亦同识的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 一窝 1 h。

5. 洒涤 Buffer 洒铁板三次，转为金属氧化物试管，100 ml/well，避光简化学反应 10～15 min。

6. 转为 H2SO4 终因止简化学反应，50 ml/well。

7. ELISA Reader 擦除 OD 490 光密度取值，系统性和更为医护人员抗基底代和造显现出异常血 清代中所 TFAR19 自身抗基底的表示水准。

8. Western blot 系统性医学表现细胞和造显现出异常细胞的 TFAR 19 激酶的表示水准。

参考文献

Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

文章来源：白花园站友 midas

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